冬虫夏草的真伪鉴别概述-人工改重案例

发布日期:2022-03-02 08:57:28


  冬虫夏草是一味具有卓佳效用的中药材,但因数年间人们的需求量不断增加,天然生长的冬虫夏草储备量却不断减少,而人工替代品大多难以达到期望,因此市场上买卖的冬虫夏草经常会有掺伪掺假的现象,为临床用药的安全埋下了不小的隐患。本文即从性状鉴别等四个中药鉴定学学科主要的鉴别角度出发,通过查阅相关文献资料,将冬虫夏草的不同真伪鉴别方法进行一定程度的概括与归纳,为广大工作者提供一些参考。


  1性状鉴别


  药材的性状鉴定内容一般包括形状、大小、表面特征、断面、气味等多方面,结合相关文献[4,5,6]可将正品冬虫夏草性状特点总结如下。


  冬虫夏草为麦角菌科(Clavicipitaceae)真菌冬虫夏草菌Cordycepssinensis(BerK.)Sacc.寄生在蝙蝠蛾科昆虫幼虫上的子座及幼虫尸体的干燥复合体。虫体似蚕,长度约30~50mm,直径3~8mm;虫草一般为深黄或黄棕色,环纹20~30个不等;虫草通常拥有8对足样的结构,较为明显的4对靠近中部,其质地非常脆弱,折断后呈淡黄白色。一般为深棕色至棕褐色的子座较虫体更为细长,长约40~70mm,有约3mm的直径,一些细的纵皱纹会分布于其上,上面的顶部会稍加膨起质地却较为坚韧。闻起来较腥,尝着有苦味。


  在伪品中通常会有北虫草等相关种类,或是利用唇形科的地蚕进行冒充。甚至有人通过自我加工将面粉、石膏等制造成虫草模样[7],但若用口尝会有难嚼感,且淀粉遇碘的试验会显阳性[8]。


  此外,也有学者[9]发现,用开水去浸泡正品的虫草其会呈现一种泡发的感觉,即整个体积会增大且变得松软,而子座的颜色便逐渐加深;伪品虫草则不会产生但颜色变化反之。随着虫草种类不断被发现,仅靠性状鉴定特征无法满足辨别的要求,因此一般多种鉴别方法相互结合会极大提高成功率。

冬虫夏草的真伪鉴别概述

  2显微鉴别


  药材的显微鉴定内容一般包括组织鉴定和粉末鉴定等主要方面,结合相关文献[10,11,12],冬虫夏草相关的鉴定特点可归纳如下。


  子座头部横切面:一般会有类似椭圆形的单独一圈的子囊壳环绕在子座四周,存在约8个以下不等的子囊孢子于多个子囊内,菌丝则满布于子座的中间位置。虫体横切面:一般无特定形状,菌丝同样满布于有裂隙的躯壳内,躯壳则环绕于周围部分,有的上面会有一些绒毛存在。


  陈小秋等[14]从冬虫夏草虫体的体壁细胞的一些外层纹理与表层刚毛的诸多特征等内容出发,对新疆虫草、亚香棒虫草等主要伪品进行了粉末显微鉴定,总结出一种较为便捷的显微鉴别虫草的规律。李文佳等[15]还对冬虫夏草分离出的菌丝超微结构的相关特征进行了一定的归纳,均可以作为冬虫夏草粉末的鉴别要点。


  3理化鉴别


  3.1一般理化鉴别


  李琰[16]采取乙醚对虫草粉末进行浸提操作,再用三氯甲烷进一步洗提,依次滴加适量的冰醋酸、乙酸酐与浓硫酸试液,冬虫夏草提取液原本的棕黄色就会被发现能够产生红紫色的过渡变化,之后污绿色才最终呈现出来。傅道珍[17]通过实验发现,用酸性的醇溶液提取冬虫夏草后,将提取液置于紫外灯(365nm)条件下,会有淡蓝色的荧光显现,黄绿色荧光会显现在亚香棒虫草的样品上,其他虫草样品则无明显变化。在同等条件下,利用水浸提虫草,浸提液置于紫外灯下会有黄蓝色荧光显现,青黄荧光会出现在地蚕样品上,其他虫草样品上仍无明显变化,可见结果具有较大差异。


  3.2色谱法


  3.2.1薄层色谱法


  [18]邓勇等采用采用纤维素薄层板,以乙酸乙酯-吡啶-醋酸-水(7.0∶3.0∶0.2∶1.4)为展开剂分离多糖水解后的单糖组分,利用苯胺-邻苯二甲酸显色后采用薄层扫描仪于410nm波长下扫描定量,发现不同种类虫草多糖其单糖比例存在一定差异,此特征可为虫草与其他伪品的鉴别提供依据。


  3.2.2蛋白电泳色谱法


  [19]李文庆等发现,大于100kDa的主蛋白条带都会发生出现在新疆虫草、凉山虫草、亚香棒虫草等虫草蛋白图谱上的情况,而在鲜冬虫夏草蛋白图谱上最终得到了多个主蛋白条带,约15个,均小于100kDa,最小的位于25kDa附近,可见在一定程度上能够加以辨别区分。通过自己所获得的蛋白凝胶图谱显示表明,[20]李春红发现凭借2-DE分析全蛋白得到的结果指出,有较为明显的差异存在于26个样品含有的蛋白点个数与这些样品的丰度之间,最后便可将不同产地的虫草样品均划分为来自西藏或来自青海两类。


  3.2.3毛细管电泳色谱法


  通过建立的较为快速、较为便捷的毛细管电泳色谱法,李栋等[21]将腺嘌呤、次黄嘌呤、次黄苷等9个核苷和碱基类的成分含量分别在冬虫夏草与人造蛹虫草子实体中确认,并发现不同成分在二者间均存在明显差异,因此本方法对虫草真伪鉴别存在一定的参考价值。


  3.2.4高效液相色谱法


  张薇薇等[24]采用HPLC-ELSD测定冬虫夏草中虫草酸含量,结果发现野生冬虫夏草中虫草酸含量大于人工北虫草,虫草人工发酵菌粉又次之。张萍等[25]采用HPLC-RID技术测定发酵虫草制剂中虫草酸含量,结果表明各制剂之间虫草酸的含量差异较大,可作为一定的鉴别依据。


  涂永勤等[26]利用HPLC及药典委员会指纹图谱软件,建立冬虫夏草的指纹图谱,并比较野生冬虫夏草与室内人工培殖冬虫夏草化学成分的差异。结果野生冬虫夏草与室内人工培殖冬虫夏草指纹图谱有85个共有峰,仅有0.72的相似度,差异明显。


  3.3光谱法


  3.3.1紫外-可见分光光度法


  [30]高明等研究中发现,在紫外吸收光谱的200~300nm波长范围内,冬虫夏草只有两个吸收峰,而湖北虫草有3个吸收峰,且吸光度强于冬虫夏草,两者存在显著差异故可鉴别。


  3.3.2红外分光光度法


  詹泽苹等[31]在实验过程中为了将红外测试施用于野生冬虫夏草、繁育冬虫夏草以及伪品,如蝉花、中华被毛孢菌丝粉等,故设法通过红外指纹图谱检测方法而达成目的,结果发现在3000~2800cm-1、1800~1000cm-1、1000~800cm-1峰型与伪虫草谱图存在较大差异。宋文军[32]也曾运用FT-IR法得到了野生虫草的分别为1746cm-1,1656cm-1、1549,1155cm-1及1082,1023cm-1的特征吸收峰,并经过进一步的分析与处理丰富了其红外信息,进而可用于对伪品虫草进行鉴别。


  3.3.3核磁共振光谱法


  陈罡等[33]首先将蝉花、中华被毛孢菌丝粉在内的4种伪品冬虫夏草分别进行了水提与醇提,紧接着再将21批野生冬虫夏草同样进行水提操作,最后把4种伪品虫草的核磁图谱同野生虫草进行对比,结果发现均存在一定的差异,9组特征标记峰或多或少都存在缺失的情况,如前者虫草花缺少1号及5-8号峰;后者虫草花缺失3、7、8号峰,蝉花缺失3号,故证明该核磁指纹图谱具有很强的特征性,能够较好地用以区分虫草伪品。


  3.4色谱光谱联用法


  为了能够建立起冬虫夏草及蛹虫草、凉山虫草、古尼虫草等伪品虫草的关于水溶性成分的指纹图谱,[23]黄彪等在实验过程中运用高效液相色谱法一共标记了16个共有峰,紧接着这些在实验过程中被标记的16个共有峰,凭借超高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱(UPLC/Q-TOF-MS)技术的支持,最终鉴定出其中12个共有峰,故在一定程度上可进行对于伪品的分析鉴别。在整个针对于野生冬虫夏草与人工虫草中糖类含量的研究过程中,Guan等[28]运用GC-MS技术对其中无论是聚合型还是游离型的糖类物质进行了进一步的分析,分析结果表明,游离甘露醇的含量在野生冬虫夏草中超过7.99%,而游离甘露醇的含量在其他虫草中却不足5.83%,这个结果能够体现出色谱光谱联用法在真伪鉴别领域的发挥成效。在高效液相色谱-质谱联用技术基础上,李文庆等[29]建立了关于冬虫夏草蛋白LC-MS的对照图谱,其中共有9个共有峰被标示,在12批冬虫夏草样品指纹图谱当中,对照图谱痛这些指纹图谱的相似度发现均大于0.90,而其他虫草样品指纹图谱在比较之后发现相似度却小于0.10,说明该种方法具有一定的适用性,更有利于冬虫夏草的真伪鉴别。


  4分子生物学鉴别


  4.1DNA分子标记鉴定


  通过一种经过改良的CTAB方法,在冬虫夏草样品当中,张喜库等[35]成功提取到总DNA,接着为了对虫草样品进行特异性扩增,他们着手设计一对特异性引物,最终通过rDNA中的ITS1区序列得以完成。结果发现255bp大小的目的片段能够被标准品以这种方法扩增得到,其他多数虫草样品却未能达成,因此通过该种技术能够有望发展为一种更有效的冬虫夏草鉴别方法。段庆梓等[36]建立的酶联免疫吸附法(PCR)体系能够对所收集的13批冬虫夏草扩增出164bp的单一条带,而在其他虫草如凉山虫草上却未出现扩增现象,这也能够为真伪鉴别提供新的方法思路。刘杨[38]在实验过程中成功建立了冬虫夏草及古尼虫草、蝉花、大凉山虫草等5种常见伪品的分子身份证短片段,于ITS序列的基础上,为冬虫夏草的真伪鉴别指出了一个较为高效快速方向。


  4.2DNA分子条形码鉴定


  通过采用DNA条形码鉴定技术,6种116份虫草菌和146份寄主在[39]苏燕燕等实验过程中分别进行了分析鉴定,结果表明,无论是基于ITS序列还是同COⅠ序列结合,均可使冬虫夏草与混淆伪品的快速检测与鉴别在极大程度上得到实现。[40]马红梅等同样采用DNA条形码鉴定技术,创造出了一种更加适用于冬虫夏草和新疆虫草的快速鉴别的方法。他们在ITS序列和18S序列两种选择层面上进行了一定的分析比较,以实现最适合于冬虫夏草和新疆虫草的特征序列片段的选取。


  4.3环介导等温扩增


  在之前相关实验报道的基础上,彭树英等[41]又建立了一种采用可视化环介导等温扩增(loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)技术去鉴定冬虫夏草的方法,在实验过程中得到了一定的结论,如果具有与引物相同序列的冬虫夏草,那么子座和虫体才会产生条带,而条带在其他伪品虫草上并不会出现,故可证明可视化LAMP能够在一定程度上使冬虫夏草真伪的快速检测得以实现。


  5讨论与展望


  伴随着我国综合国力的不断发展,人们的生活水平与健康意识都在潜移默化地提升,而冬虫夏草,不仅仅作为一种具有良好药用价值的中药[41],更作为一种如今大受欢迎的保健用品,虫草产出量已然远不足以满足市场各方面的需求,加之价格愈攀愈高,鉴定、研究、保证其品种和质量便成为目前尤为重要的大趋势。作为推动我国中医药事业发展的后生军,我们更应该努力发挥己能,相信在未来一定能够打造形成一套更为准确、更为高效、更为便捷、更为节能的中药鉴定体系,进一步丰富和促进现代中药科学的发展。


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